抗CD45抗體用于吞噬作用研究——云克隆抗體又登Cell
文章主題：Size-Dependent Segregation Controls Macrophage Phagocytosis of Antibody-Opsonized Targets
簡單來說：抗原的大小是巨噬細胞進行有效吞噬的決定性因素
信息及鏈接：Cell. 2018 Jun 28;174(1):131-142.e13. doi: 10.1016/j.cell.2018.05.059.
背景：巨噬細胞通過靶向抗體調理細胞進行吞噬作用來保護機體免受疾病損傷。盡管不同結構，形狀和大小的抗原都能誘導產(chǎn)生抗體，但是為什么有些抗體在激發(fā)免疫應答等過程中比其他抗體更有效，這個機制還不清楚。在這篇文章中，研究者們就對其中的機制進行了研究。
亮點：
1. 抗體依賴的巨噬細胞吞噬作用依賴于抗原的大?。?/p>
2. 短抗原促進細胞之間的緊密接觸以及CD45的分離；
3. CD45的分離不依賴于整合素，會引起ITAM的磷酸化；
4. 靶向短抗原的抗體促進有效的吞噬作用。
下面我們來看看研究者們是怎么通過精巧的實驗設計，最終得到這些結論的：
首先，通過設計一組體外模型（包裹脂質雙分子層（SLB）和抗體的玻璃微球）模擬被巨噬細胞吞噬的靶物質，然后將微球與RAW264.7巨噬細胞細胞共孵育，通過共聚焦顯微技術觀察體外模擬的巨噬細胞吞噬過程。
結果顯示：吞噬作用隨著抗體濃度的升高而增強，同時，還能通過與巨噬細胞共培養(yǎng)的抗CD16（Fc?RIII）和抗CD32（Fc?RIIIB）的抗體共孵育而被阻斷，說明SLB包裹的微球內(nèi)化是Fc?R特異性的。
此后，為了了解抗原大小對于吞噬作用的影響，研究者們先后設計了兩組基于Fibcon和CEACAM的不同長度的抗原。觀察吞噬過程發(fā)現(xiàn)：巨噬細胞對微球的吞噬作用隨著微球上包裹抗原增長而顯著降低。
由于吞噬作用和抗體濃度是相關的，所以為了證明抗原長度對吞噬作用的影響不僅僅發(fā)生在某個特定的抗體濃度，研究者又設計了不同抗體濃度下的實驗。（邏輯是不是很縝密？）
結果顯示：不同的抗體濃度下吞噬作用與抗原長度還是呈負相關的趨勢，并且當抗原長度大于10nm時，會顯著降低吞噬作用。
接下來，為了研究吞噬依賴于抗原長度的原因是否在于ITAM信號變化，研究者們觀察了吞噬過程中磷酸化酪氨酸在細胞中的分布，結果發(fā)現(xiàn)：短抗原內(nèi)化過程中有豐富的ITAM酪氨酸磷酸化，但長抗原則沒有。
而為了確定Fc?R ITAM磷酸化是否隨著抗原長度改變而發(fā)生了變化，他們應用全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRF）對特定設計的ITAM磷酸化傳感器（sensor）進行觀察，了解ITAM磷酸化的動力學。
結果顯示：隨著抗原長度增加，sensor的富集程度顯著降低，并且，這種依賴于抗原大小的Fc?R ITAM磷酸化還不僅僅出現(xiàn)在單個的抗原家族中，也就是說有一定的普遍性。
進一步來說，由于靶物質上抗體濃度可以調節(jié)吞噬作用，為了確定不同長度的抗原簇中Fc?R的有效濃度不同是不是導致吞噬作用與抗原長度相關性的主要原因，通過計量抗體-Fc?R復合物的濃度發(fā)現(xiàn)，長抗原對應的抗體濃度比短抗原只有輕微降低，而這個現(xiàn)象可以由二維空間內(nèi)受體-配基的親和力依賴于他們的大小尺寸得以解釋。進而研究者們還通過構建大質膜泡，檢測到抗原長度變化只會引起受體-配基親和力的輕微降低，進而說明吞噬作用主要依賴于抗原大小的差異，而不是親和力或者密度。
Fc?R ITAM的磷酸化能夠被受體酪氨酸磷酸酶CD45、CD148逆轉，為了研究抑制磷酸酶在抗體Fc?R富集的膜上是怎樣進行空間分布的，研究者們通過TIRF觀察了CD45在巨噬細胞和SLB的接觸面上的分布。
結果顯示：短抗原參與的吞噬接觸面上抗體與CD45之間有顯著的分離，而長抗原則沒有這種現(xiàn)象。同時，共定位分析及抗原、抗體及受體的計算分析顯示：大約10nm的大小是一個閾值，當抗原長度小于這個閾值就會導致CD45被分離。
基于以上的結論，為了進一步求證CD45的分離對于Fc?R磷酸化和吞噬作用是否是必須的，研究者們使用CRISPR/Cas9截短了內(nèi)源性的CD45胞外段進行實驗，發(fā)現(xiàn)截短的CD45使短抗原介導的吞噬作用顯著降低了。
綜上，結論如下：抗原大小很大程度上決定了抗體依賴的吞噬作用是否成功，而這個吞噬作用又是通過大小依賴的CD45分離導致的Fc?R磷酸化來完成的。（做基礎研究的文章，它的結論就是這么傲嬌的拗口）
簡單來說，是這樣一個結論：
抗原大小越小會導致抗體結合的Fc受體與抑制性磷酸酶CD45分離，進而激發(fā)Fc受體磷酸化，并促進吞噬作用。由此作者為治療性抗體提出一個建議：選取短抗原作為抗體的靶標。
本文中用于檢測CRISPR/Cas9編輯的CD45分子的抗小鼠CD45抗體來自Cloud-Clone?。?！